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饲料中的氨基酸 检测方法包

更新时间:2016-10-21      点击次数:3624

 

饲料中的氨基酸 检测方法包

杭州天钊科技有限公司

. 仪器及试剂

器:

1). 天平一台(精度0.1mg);

2). 恒温水浴锅一台;

3). 容量瓶;

4). 试管(1.5×15cm1.5×10cm);

5). 微量进样器(5ul10µl)一支;

6). 微量可调移液枪(1000ul)一支、吸头多个;

7). 旋涡混匀器一台;

8). HPLC系统及氨基酸分析柱(4.6×250mm);

9). LC500梯度系统一台

剂:

1). 超纯水(≥18MΩ?cm);

2). 乙腈(HPLC级);

3). 三水合醋酸钠(分析纯);

4). 冰醋酸(分析纯);

5). 衍生试剂A和衍生试剂B溶液,至于冰箱保存(衍生试剂包对身体有害,用时请做好防护措施);

6). 正己烷(HPLC级)。

 

二:样品制备

准确称取饲料10-50 mg,置于25 mL具塞比色管中,加1.0 mol/L盐酸10 mL,搅拌提取15 min,静置10分钟,将上清液过滤到100 mL容量瓶中,残渣加1.0 mol/L盐酸10 mL,搅拌3 min,重复提取两次,合并上清液,收集滤液并加1.0 mol/L盐酸定容至刻度,摇匀。

. 流动相的配制

流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(pH 6.5):乙睛=937

配制方法:准确称取三水合醋酸钠13.6g1000ml水中,搅拌均匀,使之溶解,用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.5;准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液465ml和乙腈35ml,混合均匀,抽滤过0.45µm滤膜; 

流动相B水:乙腈=2080

配制方法:准确量取水100ml和乙腈400ml,混合均匀,抽滤过0.45µm滤膜;

 

. 衍生化反应

1. 对照品溶液的制备

17种氨基酸对照品溶液用水稀释至原来浓度的1/10倍稀释作为对照品。

17种氨基酸对照品溶液稀释10倍后,各氨基酸的浓度为:

Name

M.W.

C(mmol/L)

C(mg/ml)

Name

M.W.

C(mmol/L)

C(mg/ml)

门冬氨酸

133.10

0.25

0.03328

胱氨酸

240.30

0.125

0.03004

谷氨酸

147.13

0.25

0.03678

缬氨酸

117.15

0.25

0.02929

丝氨酸

105.09

0.25

0.02627

氨酸

149.21

0.25

0.03730

甘氨酸

75.067

0.25

0.01877

异亮氨酸

131.17

0.25

0.03279

组氨酸

155.15

0.25

0.03879

亮氨酸

131.17

0.25

0.03279

精氨酸

174.20

0.25

0.04355

酪氨酸

181.19

0.25

0.04530

苏氨酸

119.12

0.25

0.02978

苯丙氨酸

165.19

0.25

0.04130

丙氨酸

89.093

0.25

0.02227

赖氨酸

146.19

0.25

0.03655

脯氨酸

115.13

0.25

0.02878

 

 

 

 

2. 供试品溶液制备

精密量取/称取供试品适量,并配制成相应浓度的溶液备用。

3. 衍生步骤

1)将恒温水浴锅预热至50±1

2)分别将AB两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍;

3)精密量取上述对照品溶液1ml,置于试管中,加入稀释后的A溶液0.5ml和稀释后的B溶液0.5ml,摇匀;在50±1℃水浴中加热45分钟,取出,加入正己烷溶液1ml,振摇;并用孔径为0.45μm有机膜过滤,放置30分钟后,取澄清的下层液进行分析试验;

4)供试品的衍生步骤与对照品相同;

 

. 色谱条件

1. 色谱柱:Ultimate® AA5μm4.6×250mm

2. 梯度程序

流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(pH 6.5):乙睛=937

流动相B 水:乙腈=2080

T(min)                    A%                          B%

0.01                     100.0                      0.0

11                        93.0                      7.0

13.9                      88.0                       12.0

14                        85.0                       15.0   

29                        66.0                       34.0

32                        30.0                     70.0

35                         0.0                    100.0

42                         0.0                    100.0

45                       100.0                      0.0  

60                       100.0                      0.0

流 速:1.0ml/min

柱 温:40

   长:254nm

 进样量:5μl

 工作站记录时间:60min

色谱图:

. 操作步骤和注意事项

1. 操作步骤:

1)设置柱温40和流速1.0ml/min

2)将AB两个通道用乙腈:水=2080排尽气泡(如B通道的原存留液中不含缓冲盐,则无需用乙腈:水=2080排气泡),B通道用流动相B再排尽气泡;

3)用乙腈:水=2080A通道)冲洗系统20min,以防止缓冲盐析出;

4A通道用流动相A排尽气泡,然后用流动相A走基线30min,平衡色谱柱;

5)运行一次空白梯度;

6)进样分析;

7) 分析完成后:

I)用乙腈:水=2080代替流动相A,进水样(清洗自动进样器),进行梯度洗脱;

II)换90%乙腈冲洗色谱柱40min以上;

2. 注意事项:

1)进样分析:先进对照品溶液,后进供试品溶液;

2)缓冲溶液,隔天需重新配制;

3)防止缓冲盐析出。

  氨基酸方法包,主要包括:

产品名称

备注

LC500液相色谱仪梯度系统一套

天平一台(精度0.1mg

 

恒温水浴锅一台

 

容量瓶

 

试管(1.5×15cm1.5×10cm

 

微量进样器(100µl)一支

 

微量可调移液枪(1000ul)一支、吸头多个

 

旋涡混匀器一台

 

HPLC 2000色谱工作站

 

氨基酸分析柱(4.6×250mm

 

超纯水(≥18MΩ?cm

 

Welpure 乙腈 4*4LHPLC级)

 

三水合醋酸钠(分析纯)

 

冰醋酸(分析纯)

 

Welpure正己烷 4*4LHPLC级)

 

衍生试剂A1瓶,10ml/

 

衍生试剂B1瓶,10ml/

 

氨基酸衍生试剂稀释剂,6瓶,10ml/

 

氨基酸标准溶液,2瓶,1ml/

 

联系我们

杭州天钊科技有限公司 公司地址:杭州市西湖区金蓬街321号2幢C座511室   技术支持:化工仪器网
  • 联系人:刘经理
  • QQ:35102228
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  • 邮箱:sales1@wookhplc.com

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