饲料中的氨基酸 检测方法包
杭州天钊科技有限公司
一. 仪器及试剂
仪 器:
1). 天平一台(精度0.1mg);
2). 恒温水浴锅一台;
3). 容量瓶;
4). 试管(1.5×15cm或1.5×10cm);
5). 微量进样器(5ul或10µl)一支;
6). 微量可调移液枪(1000ul)一支、吸头多个;
7). 旋涡混匀器一台;
8). HPLC系统及氨基酸分析柱(4.6×250mm);
9). LC500梯度系统一台
试 剂:
1). 超纯水(≥18MΩ?cm);
2). 乙腈(HPLC级);
3). 三水合醋酸钠(分析纯);
4). 冰醋酸(分析纯);
5). 衍生试剂A和衍生试剂B溶液,至于冰箱保存(衍生试剂包对身体有害,用时请做好防护措施);
6). 正己烷(HPLC级)。
二:样品制备
准确称取饲料10-50 mg,置于25 mL具塞比色管中,加1.0 mol/L盐酸10 mL,搅拌提取15 min,静置10分钟,将上清液过滤到100 mL容量瓶中,残渣加1.0 mol/L盐酸10 mL,搅拌3 min,重复提取两次,合并上清液,收集滤液并加1.0 mol/L盐酸定容至刻度,摇匀。
三. 流动相的配制
流动相A: 0.1mol/L醋酸钠溶液(pH 6.5):乙睛=93:7
配制方法:准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000ml水中,搅拌均匀,使之溶解,用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.5;准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液465ml和乙腈35ml,混合均匀,抽滤过0.45µm滤膜;
流动相B:水:乙腈=20:80
配制方法:准确量取水100ml和乙腈400ml,混合均匀,抽滤过0.45µm滤膜;
四. 衍生化反应
1. 对照品溶液的制备
17种氨基酸对照品溶液用水稀释至原来浓度的1/10倍稀释作为对照品。
17种氨基酸对照品溶液稀释10倍后,各氨基酸的浓度为:
Name | M.W. | C(mmol/L) | C(mg/ml) | Name | M.W. | C(mmol/L) | C(mg/ml) |
门冬氨酸 | 133.10 | 0.25 | 0.03328 | 胱氨酸 | 240.30 | 0.125 | 0.03004 |
谷氨酸 | 147.13 | 0.25 | 0.03678 | 缬氨酸 | 117.15 | 0.25 | 0.02929 |
丝氨酸 | 105.09 | 0.25 | 0.02627 | 蛋氨酸 | 149.21 | 0.25 | 0.03730 |
甘氨酸 | 75.067 | 0.25 | 0.01877 | 异亮氨酸 | 131.17 | 0.25 | 0.03279 |
组氨酸 | 155.15 | 0.25 | 0.03879 | 亮氨酸 | 131.17 | 0.25 | 0.03279 |
精氨酸 | 174.20 | 0.25 | 0.04355 | 酪氨酸 | 181.19 | 0.25 | 0.04530 |
苏氨酸 | 119.12 | 0.25 | 0.02978 | 苯丙氨酸 | 165.19 | 0.25 | 0.04130 |
丙氨酸 | 89.093 | 0.25 | 0.02227 | 赖氨酸 | 146.19 | 0.25 | 0.03655 |
脯氨酸 | 115.13 | 0.25 | 0.02878 |
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2. 供试品溶液制备
精密量取/称取供试品适量,并配制成相应浓度的溶液备用。
3. 衍生步骤
1)将恒温水浴锅预热至50±1℃;
2)分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍;
3)精密量取上述对照品溶液1ml,置于试管中,加入稀释后的A溶液0.5ml和稀释后的B溶液0.5ml,摇匀;在50±1℃水浴中加热45分钟,取出,加入正己烷溶液1ml,振摇;并用孔径为0.45μm有机膜过滤,放置30分钟后,取澄清的下层液进行分析试验;
4)供试品的衍生步骤与对照品相同;
五. 色谱条件
1. 色谱柱:Ultimate® AA,5μm,4.6×250mm;
2. 梯度程序:
流动相A: 0.1mol/L醋酸钠溶液(pH 6.5):乙睛=93:7
流动相B: 水:乙腈=20:80
T(min) A% B%
0.01 100.0 0.0
11 93.0 7.0
13.9 88.0 12.0
14 85.0 15.0
29 66.0 34.0
32 30.0 70.0
35 0.0 100.0
42 0.0 100.0
45 100.0 0.0
60 100.0 0.0
流 速:1.0ml/min
柱 温:40℃
波 长:254nm
进样量:5μl
工作站记录时间:60min
色谱图:
六. 操作步骤和注意事项
1. 操作步骤:
1)设置柱温40℃和流速1.0ml/min;
2)将A、B两个通道用乙腈:水=20:80排尽气泡(如B通道的原存留液中不含缓冲盐,则无需用乙腈:水=20:80排气泡),B通道用流动相B再排尽气泡;
3)用乙腈:水=20:80(A通道)冲洗系统20min,以防止缓冲盐析出;
4)A通道用流动相A排尽气泡,然后用流动相A走基线30min,平衡色谱柱;
5)运行一次空白梯度;
6)进样分析;
7) 分析完成后:
I)用乙腈:水=20:80代替流动相A,进水样(清洗自动进样器),进行梯度洗脱;
II)换90%乙腈冲洗色谱柱40min以上;
2. 注意事项:
1)进样分析:先进对照品溶液,后进供试品溶液;
2)缓冲溶液,隔天需重新配制;
3)防止缓冲盐析出。
氨基酸方法包,主要包括:
产品名称 | 备注 |
LC500液相色谱仪梯度系统一套 天平一台(精度0.1mg) |
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恒温水浴锅一台 |
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容量瓶 |
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试管(1.5×15cm或1.5×10cm) |
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微量进样器(100µl)一支 |
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微量可调移液枪(1000ul)一支、吸头多个 |
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旋涡混匀器一台 |
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HPLC 2000色谱工作站 |
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氨基酸分析柱(4.6×250mm) |
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超纯水(≥18MΩ?cm) |
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Welpure 乙腈 4*4L(HPLC级) |
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三水合醋酸钠(分析纯) |
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冰醋酸(分析纯) |
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Welpure正己烷 4*4L(HPLC级) |
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衍生试剂A,1瓶,10ml/瓶 |
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衍生试剂B,1瓶,10ml/瓶 |
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氨基酸衍生试剂稀释剂,6瓶,10ml/瓶 |
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氨基酸标准溶液,2瓶,1ml/瓶 |
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