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荧光检测器原理

更新时间:2022-08-03      点击次数:4616
从电子跃迁的角度来讲,荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后,原子中的某些电子从基态中的zui低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。电子在同类分子或其他分子中撞击,消耗了相当的能量,从而下降到电子激发态中的zui低振动能级,能量的这种转移形式称为NO辐射跃迁。由zui低振动能级下降到基态中的某些不同能级,同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光,就是荧光。被化合物吸收的光称为激发光,产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要长于分子吸收的紫外光波长,通常在可见光范围内。荧光的性质与分子结构有密切关系,不同结构的分子被激发后,并不是都能发射荧光。
在光致发光中,发射出的辐射总依赖于所吸收的辐射量。由于一个受激发的分子回到基态时可能以NO辐射跃迁的形式产生能量损失,因而发射辐射的光子数通常都少于吸收辐射的光子数,它以量子效率Q来表示。
在固定的实验条件下,量子效率是个常数,通常Q小于1。对可用荧光检测的物质来说,Q值一般在0.1~0.9之间。荧光强度F与吸收光强度成正比.对于稀溶液,荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关。在其他因素保持不变的条件下,物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比,这是荧光检测器的定量基础。荧光检测器属于溶质型检测器,可直接用于定量分析。
荧光涉及光的吸收和发射两个过程,因此任何荧光化合物,都有两种特征的光谱:激发光谱(exitation spectrum)和发射光谱(emission spectrum)。
  荧光属于光致发光,需选择合适的激发光波长(Ex)以利于检测。激发波长可通过荧光化合物的激发光谱来确定。激发光谱的具体检测办法是通过扫描激发单色器,使不同波长的入射光激发荧光化合物,产生的荧光通过固定波长的发射单色器,由光检测元件检测。zui终得到荧光强度对激发波长的关系曲线就是激发光谱。在激发光谱曲线的zui大波长处,处于激发态的分子数目zui多,即所吸收的光能量也zui多,能产生zui强的荧光。当考虑灵敏度时,测定应选择zui大激发波长。
       一般所说的荧光光谱,实际上仅指荧光发射光谱。它是在激发单色器波长固定时,发射单色器进行波长扫描所得的荧光强度随荧光波长(即发射波长,Em)变化的曲线。荧光光谱可供鉴别荧光物质,并作为荧光测定时选择合适的测定波长的依据。
另外,由于荧光测量仪器的特性,使光源的能量分布、单色器的透射率和检测器的响应等性能会随波长而变,所以同一化合物在不同的仪器上会得到不同的光谱图,且彼此间无类比性,这种光谱称为表观光谱。要使同一化合物在不同的仪器上能得到具有相同特性的荧光光谱,则需要对仪器的上述特性进行校正。经过校正的光谱称为真正的荧光光谱。
激发波长和发射波长是荧光检测的必要参数。选择合适的激发波长和发射波长,对检测的灵敏度和选择性都很重要,尤其是可以较大程度地提高检测灵敏度。


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